我们都知道，从数据质控开始已经进入了scRNA分析阶段，在这个阶段开始测试代码，进行实操是很重要的。测试过程中出现的各种问题可能成为你学习路上的拦路虎。作图丫为大家总结单细胞数据分析时，标准化处理的方法和策略。
序言
????????上一期我们介绍了如何对scRNA-seq数据进行预处理与质控，在得到高质量的barcode by cell计数矩阵之后，我们需要通过基因在不同细胞间的差异表达来对细胞聚类。而数据的标准化（normalization）对于准确的比较细胞间的基因表达则是非常重要且必要的一步。今天我们就来一起了解一下如何对scRNA-seq数据标准化。
计数矩阵标准化的必要性
????????在scRNA-seq中，由于每个细胞的起始转录分子量有限，每个细胞中转录本的捕获以及扩增效率都会有技术差异，因此很难保证样本之间在文库制备上保持高度的一致性。这也造成了多个样本的测序数据中会存在由于文库测序覆盖率(sequencing coverage)?不同而引入的系统差异。数据的标准化目的就是消除这些差异，使得我们得到的分析结果不受技术噪音的影响。
数据标准化一般分为两大类：
·?样本内的标准化(within-sample normalization):?针对由基因特异性（如基因长度，GC content）产生的偏差，标准化后使得同个样本内的基因表达具有可比性。我们常用的RPKM，FPKM 和TPM就是标准化之后的表达值。
·?样本间的标准化(between-sample normalization):?针对样本间的差异，例如测序深度和转录本捕获率，标准化后的表达值能被用于不同样本间的比较。
????????在scRNA-seq分析中，我们将每个细胞视为一个独立的样本，来比较细胞内不同基因的表达。我们前期的文章提到过，在droplet-based的方法中，只对转录分子的5'?或 3'端测序，因此此类数据的标准化不需要考虑基因长度的影响，对应的就是方法类别就是样本间的标准化。
????????目前已经有很多针对bulk RNA-seq 数据的成熟的标准化方法，有些方也被用于单细胞分析。然而需要注意的是，由于scRNA-seq数据的高度稀疏性(sparsity)?和技术噪音，直接使用bulk RNA-seq的方法使得对单细胞数据中的低表达基因造成过度矫正。
下面我们主要给大家介绍两大类用于scRNA-seq的标准化方法[2,3]。
第一类常用标准化方法-log-normalization
????????大家比较熟悉的标准化方法是scaling。由于每个细胞的总计数（也可称为测序深度）不同，首先通过总计数对每个细胞估算出一个size factor，它代表了细胞间由不同测序深度带来的相对偏差值， 然后对每个细胞的总计数除以特定的size factor，以此来达到消除偏差的目的，得到“normalized expression values”用于下游分析。如果在scRNA-seq中用到了spike-ins 或 UMIs，标准化的操作则要根据它们的结果来进行调整。一些用于scRNA-seq的方法有：
· CPM (counts per million) normalization:?这个方法假设所有细胞包含等量的mRNA分子，测序深度的差异仅来源于抽样，即相对偏差全部都体现在细胞的不同计数总和上；因此估计的size factor与细胞计数总和成正比。这个方法在bulk RNA -seq中也很常用。方法对应的R包: Seurat [3]，scater [4]?。
· High-count filtering CPM:?是在CPM的基础上，考虑到少数高表达基因对细胞偏差估计的影响，在估算size factor时剔除细胞中表达量高于5%的总计数的基因。
· Scran:?针对单细胞测序的dropout和0计数现象，scran通过合并 (pool)?总计数类似的细胞，通过它们的计数总和来估算一个size factor，然后将其进一步分解，用到每个细胞表达谱的标准化中。R包: scran [5]。
· BASiCS:?基于spike-ins来推断细胞特异的size factor。R包: scRNAseq [6]。
以上这些方法都基于一个假设：对于样本中所有细胞，它们的转录分子量都是相同的。这样同一个size factor才能被用于细胞中的所有基因。
????????在标准化之后，计数矩阵还需要做log(x+1)?转化。由于在衡量表达值差异大小的时候，我们通常使用的是表达值的对数倍变化(log-fold change)，因此需要对计数矩阵作进一步的对数转化。并且由于很多下游的分析工具?(例如差异表达分析)?都假设数据是正态分布的，然而我们知道scRNA-seq数据实际上并不一定满足，因此对数转换则能帮助我们降低数据的skewness，尽管方法比较粗糙但是对之后的分析很实用。
????????在log(x+1)?转化中的+1是加上的一个伪计数(pseudo-count)?，用来避免未定义的数值0。伪计数的选择比较多，用+1的原因是能保留原始矩阵中的sparsity，即原始表达值为0的在对数转换后仍然为0。当然，你也可以选择其他的数值，如果选择较大的伪计数，低表达基因之间的对数倍变化则会变小，使得下游的差异分析结果由高表达基因主导；反之选择较小的伪计数则能增加低表达基因在差异分析结果中权重。大家可以根据自己的研究目的来调整选择的参数。
以上两步(scaling & log-trans)?结合起来通常被称作“log-normalization”?，这类方法比较简单并且常用。
第二类常用标准化方法-?probabilistic?model?based?approach
????????另外一类标准化方法比较新颖，也更加复杂，是通过拟合分布来对细胞计数构建模型(model molecule counts using probabilistic approaches)，用模型拟合的残差 (residuals)?作为基因表达的标准化定量。一些新的基于UMIs的方法，它们的建模主要是使用NB distribution以及zero-inflation NB distribution (ZINB)。一些常见的方法以及对应的R包/python?？橛校?/p>
·?ZINB-WaVE（R包:?zinbwave）[7]
·?scVI?（python?模块:?scvi）[8]
·?DCA?（python??？? dca）[9]
regularized negative binomial regression (R包: sctransform; also being wrapped in Seurat)?[10]。
与前面估算size factor的方法不同，这类模型拟合类方法通常将批次矫正和数据标准化结合到了一起，不需要分步处理。
Seurat: log-normalization vs. sctransform
????????或许大家会注意到R包Seurat提供了两种标准化的选择：log-normalization 和sctransform。Hafemeister et al.,[10]?对比了这两种方法，发现log-normalization对不同表达量的基因标准化效果不一致，只有中等以及低表达的基因被有效的标准化了，表明“size factor”并不是对所有基因都有效，并且这个是否有效的差异与测序深度相关 (Figure 1D from [10])。
????????而在r包sctransform中，他们通过构建regularized negative binomial regression 模型，对比发现模型残差能有效的标准化表达值，而且残差的方差(variance of residuals)?不受测序深度影响?(Figure 3C from [10])。在他们的pipeline中也提到，如果研究涉及到多个不同scran-seq数据的合并?(特别是不同protocols生成的数据)，建议使用sctransform，运行时间比传统的log-normalization会短很多。
小tip:?数据标准化(normalization)?和批次矫正(batch correction)?之间有什么区别吗？标准化只考虑技术偏差，与有没有批次效应无关；而批次矫正，顾名思义，是特指出现在不同批次之间的差异，需要同时考虑技术偏差和生物学差异。技术偏差一般对具有相似特征??(例如长度，GC content)?的基因造成的影响也是类似的，而批次之间的生物学差异则要复杂的多，而且难以预估。因此这两个步骤涉及了不同的方法，大家千万主要不要混淆了这两个概念。
小编总结
标准化方法的选择很多，因为毕竟没有一种方法能适用于所有类型的scRNA-seq数据。在大多数的单细胞分析教程中log-normalization还是比较常用的方法，因为它相对简单并且容易实现。从我个人的分析经验来说，我尝试过用不同的数据对比文中提到的两大类方法，在细胞聚类上结果并没有显著的差异。不过因为具体数据的特异性，建议大家在了解方法的基础上，多多尝试不同的方法，特别在当聚类结果不太理想的时候。我们之后也会为大家介绍系统比较这些方法的文章，V信搜索：作图丫，可获取更多精彩内容。
参考资料/文献
1.?Hwang, B., Lee, J.H. & Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.?Exp Mol Med?50,?96 (2018). https://doi.org/10.1038/s12276-018-0071-8
2.?Luecken MD, Theis FJ. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.?Mol Syst Biol. 2019;15(6):e8746. Published 2019 Jun 19. doi:10.15252/msb.20188746
3.?Stuart T, Butler A, Hoffman P, et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data.?Cell. 2019;177(7):1888-1902.e21. doi:10.1016/j.cell.2019.05.031
4.?McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Willis QF (2017). “Scater: pre-processing, quality control, normalisation and visualisation of single-cell RNA-seq data in R.”?Bioinformatics,?33, 1179-1186. doi:?10.1093/bioinformatics/btw777.
5.?Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC (2016). “A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor.”?F1000Res.,?5, 2122. doi:?10.12688/f1000research.9501.2.
6.?Risso D, Cole M (2020).?scRNAseq: Collection of Public Single-Cell RNA-Seq Datasets. R package version 2.2.0.
7.?Risso D, Perraudeau F, Gribkova S, Dudoit S, Vert J (2018). “A general and flexible method for signal extraction from single-cell RNA-seq data.”?Nature Communications,?9, 284.?https://doi.org/10.1038/s41467-017-02554-5.
8.?Lopez R, Regier J, Cole MB, Jordan MI, Yosef N. Deep generative modeling for single-cell transcriptomics.?Nat Methods. 2018;15(12):1053-1058. doi:10.1038/s41592-018-0229-2
9.?Eraslan, G., Simon, L.M., Mircea, M.?et al.?Single-cell RNA-seq denoising using a deep count autoencoder.?Nat Commun?10,?390 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-018-07931-2
10.?Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol 20, 296 (2019). https://doi.org/10.1186/s13059-019-1874-1
