1. Author
Jim是一名传染病专家和病毒学家，他的研究重点是预防和治疗免疫功能低下患者等弱势人群的病毒感染。他利用创新的免疫学方法来研究抗原特异性B细胞和抗体对呼吸道病毒的反应。他还设计并进行抗体的临床试验，以?；っ庖吖δ苁芩鸹颊呙馐芎粑啦《镜母腥尽?/p>
2. Background
2.1 3T3细胞
3T3细胞：是G．J．Todaro等从Swiss系小鼠胎儿里得到的细胞株。由于它显示出强烈的接触抑制作用，所以能明确地识别已发生转化的细胞，并作为一种重要的细胞材料使用于由肿瘤病毒和致癌剂等所引起的体外致癌研究。这一细胞系是将3×105细胞接种在底部直径为5厘米的培养皿上，是根据每三天进行一次连续培养的方法而建立的。3T3这一名称便由此而得。同样，由6×105细胞或12×105细胞进行接种而得的细胞株，分别称为3T6和3T12，这些细胞的接触抑制作用很弱。此外，在与3T3同一类的细胞中，有来自Balb/C系小鼠的Balb 3T3细胞。
NIH/3T3 细胞：细胞种类：小鼠成纤维细胞；细胞来源：swiss小鼠胚胎；培养基种类：DMEM+10%小牛血清；细胞状态与特征简述：NIH/3T3 细胞对肉瘤病毒灶性形成及白血病病毒繁殖高度敏感，常用来做DNA转染的受体细胞。细胞融合80%或更少时传代，每周至少2次，决不能使其融合率更高。细胞贴壁生长。
3T3一L1：成纤维细胞3T3一L1是来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株，是国际上公认的研究脂肪细胞分化的细胞模型。
2.2 细胞STR鉴定方法
实验原理
短串联重复（Short Tandem Repeats，STR），又称微卫星DNA（Microsatellite DNA）或简单重复序列（Simple Repeat Sequence，SRS或SSR），是存在于原核生物和真核生物基因组中的一种核苷酸重复序列。这些序列在有丝分裂过程中，由于DNA链之间的错配引起的复制滑动而产生，复制滑动的概率因复制单元大小和物种的不同而异。
STR由核心序列（core repeat units）首尾相连多次重复形成。每个STR的核心序列结构相同，长度在2-6bp之间，但重复单位数目和重复区域的长度因物种和种族的差异而异。这种差异构成了STR的遗传多态性。在同一STR位点，不同种族和人群之间存在重复次数的差异，因此STR位点的分析可用于个体身份识别，类似于指纹识别。通过在特定位点识别基因组中的特定序列重复，可以建立个体的基因档案。
STR分析法已经成为一种重要的鉴定分析方法，应用广泛于法医学、亲子鉴定以及细胞鉴定等领域。通过检测特定STR位点上的序列重复，可以确定个体的独特基因特征，实现精准的身份鉴定和分析。
细胞STR鉴定方法
1.对正常细胞系的鉴定
对正常细胞系的鉴定是一个涵盖多个方面的过程，主要包括以下四个方向：
（1）确定细胞的种系来源，采用常见的技术如染色体分析、同工酶分析以及DNA指纹图谱等。
（2）确认细胞的组织来源，可通过形态学特征观察和检测组织特异性抗原等方式进行鉴定。
（3）评估细胞是否发生了转化和恶变，主要依据核型分析、细胞生长行为观察（是否失去接触抑制）、裸鼠成瘤实验等进行检测。
（4）检查细胞是否受到交叉污染，利用同工酶和DNA指纹图谱技术进行确认。
2.对肿瘤细胞系的鉴定
在肿瘤细胞系的鉴定中，焦点主要集中在评估其恶性特征。这涵盖了染色体异常、接触抑制和密度依赖生长特性的变化、集落形成能力、裸鼠成瘤实验、动物体内的侵袭生长，以及一些基因和分子水平的特征。
3.对干细胞系的鉴定
对于干细胞系的鉴定，主要关注于检测细胞的多能性。传统的鉴定方法包括核型分析、拟胚体（EB）形成分析、三胚层分化检测、碱性磷酸酶染色、多能性标志物检测以及畸胎瘤检测等手段。这些方法有助于确认细胞是否表现出干细胞的特有特征。
常见问题
1.如何确认细胞系是否发生了交叉污染：
在存在细胞系交叉污染的情况下，进行STR位点检测时会观察到多个位点出现两个以上的峰。这些峰的高度表示相应等位基因的信号强度，理论上与样本的DNA浓度直接相关。在混合细胞系中，某些峰会明显高于其他峰，其中主要细胞系的峰是高峰，而次要细胞系的峰是低峰。需要注意的是，当两个或更多细胞系混合时，检测结果可能类似于细胞系的“遗传不稳定”，尤其是对于一些癌细胞系。由于遗传不稳定性，一些STR位点的特性可能不同。因此，经验丰富的分子专家对于分析复杂的电泳图谱（STR峰图）至关重要，以判断是否由于细胞系交叉污染导致多等位基因情况。
2.如何根据STR数据判断细胞系的身份：
通过比对细胞系鉴定结果和STR信息与参考数据库，可以判断细胞样本的每个STR位点是否与参考细胞的STR位点匹配。匹配度≥80%可认为细胞系正确，匹配度＜80%可能表明细胞系被错误标记、交叉污染或存在遗传不稳定性。若细胞系被发现存在交叉污染或错误标记，需要使用更早代的细胞进行鉴定，找到问题的源头，或直接购买可靠机构提供的新细胞系。
3.如果细胞系未在数据库中找到匹配结果：
若数据库中未找到细胞信息，可利用细胞的遗传信息建立自己的遗传特性，以后期与自建的细胞库进行比对。
4.为何报告中结论无法匹配任何已知数据：
最可能的原因是该细胞系的标准序列未被收录在国际细胞库中，导致送检样本与任何序列都不匹配。这种情况大多是由于该细胞系可能是由国内课题组自主建立的。
5.对于STR位点引物设计的要求：
设计其实很简单，并且很容易使用。但是由于这个位点的选择和优化是非?？菰锊⑶液氖焙牧Φ墓ぷ?，建议由专业的服务方进行设计和合成。
2.3 Palivizumab帕利珠、Nirsevimab尼塞韦单抗
1、作用机制
RSV是一种单股负链RNA病毒，包含10个基因，编码11种蛋白质。其中融合蛋白F序列高度保守，可以用来诱导产生中和抗体抑制RSV活性。融合蛋白F以三聚体形式存在，包含融合前（Pre-F）和融合后（Post-F）两种构象。Pre-F是一种亚稳定结构，当病毒与细胞发生融合后，可以向稳定的Post-F转变。目前已经鉴定的6种抗原表位（site Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和?）均存在于Pre-F蛋白中。Post-F含有4种抗原表位（siteⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。
目前已经上市的两种预防RSV抗体为尼塞韦单抗和帕利珠单抗。尼塞韦单抗一个RSV发病季仅需一针，即可达到>70%的预防有效率。而帕利珠单抗一个RSV发病季需每月注射1针，总共需要5针，达到45-55%的预防有效率。Palivizumab 帕利珠单抗（FDA）：预防儿童呼吸道合胞病毒(RSV)引起的严重下呼吸道感染。Nirsevimab 尼塞韦单抗(EMA)：预防新生儿和婴儿在第一个RSV发病季呼吸道合胞病毒(RSV)引起的下呼吸道感染。
3. Methods
1. 抗原的纯化表达
2. 抗原Tetramerization标记
3. Tetramer 富集
4. 流式分选
5. 单克隆抗体的制备
6. Fab的制备
7. 生物膜干涉实验（BLI）
8. 融合抑制实验
9. 中和实验
10. 冷冻电镜
11. 实时定量PCR
4. Results
实验团队分别通过生化实验得到了HIPV1和HIPV3的交叉抗体3x1（VH3-23/VL3-19）以及RSV和HMPV的交叉抗体MxR（VH3-21/VL1-40）。在筛选3x1时，实验团队利用了“bait & switch”的策略，以HPIV3的preF作为抗原标记后调取了结合的B细胞，并在表达CD40L/IL2/IL21的3T3细胞的辅助下活化记忆B细胞分泌抗体。后续采集培养上清进行空斑实验鉴定得到了3x1抗体。同样利用HMPV与RSV的F蛋白作为抗原，鉴定到交叉抗体MxR。
在冷冻电镜的辅助下，实验图团队进一步研究了两个交叉抗体的作用特征。发现：①3x1的作为位点为F蛋白位点X，抗体的6个CDRs中只有4个参与到相互作用中；3×1的VH和VL共同结合在HRA螺旋和sheet-turn-sheet基序之间的裂隙，这一区域对F蛋白的重排至关重要。②MxR的结合位点时位点Ⅲ，之前提及到MxR的胚系基因为VH3-21/VL1-40，但是突变位点相比于一下传统的临床抗体较多。MxR的CDR3比较短。与传统的抗体不同，MxR不和DⅡ结合。
后续的小鼠水平实验发现，单针剂量而言5mg/kg的剂量为最佳剂量，二者联合用药后无论四Qpcr结果还是滴度测定都发现有了显著的改善。
5. Discussion
作者： Madelyn Cabán
通讯作者：Jim Boonyaratanakornkit
单位：Vaccine and Infectious Disease Division, Fred Hutchinson Cancer
Center, Seattle, WA, USA.
年份：2023.02.13
期刊：Nature communications
科学问题 ：四种呼吸道病毒(HPIV1/HPIV3/RSV/HMPV)的广谱抗体策略
结论：实验团队分离得到了针对HPIV3和HPIV1的3×1，和针对 RSV 和 HMPV 的 MxR。 针对同源病毒之间功能保守的表位是一种有吸引力的策略，可以降低由于逃逸突变的出现而产生耐药性的风险； 同时，可以通过预防更广泛的病原体来增加暴露前预防的益处。 交叉中和 3 × 1 mAb 结合 HPIV3 preF 上的一个位点——位点 X。此外，3 × 1 的轻链包含 HPIV3 preF 上的一个大突出物，并在 Asp143 处形成氢键，该氢键在 HPIV1 中是保守的。MxR可中和 HMPV 和 RSV。然而，MxR 是一种体细胞高度突变的抗体，可以促进位点 III 识别，而无需 MPE8 中看到的扩展 CDRH3。在本研究中描述的交叉中和 MxR 抗体与 RSV A 和 B 亚型的 preF 蛋白强烈结合，并且还中和 HMPV。在体内功效研究中，同样施用了两种抗体 MxR 和 3 × 1 的混合物，每种抗体剂量为 5 mg/kg，总剂量为 10mg/kg。 相比于FDA批准药物的用量，本研究中测试的剂量在已投入临床使用的其他抗体的范围内，为未来人体研究中增加剂量留有空间。
